النيماتودا… العدو الخفي في المزارع

فى هذا الكتيب نتعرف على

  • أنواع النيماتودا
  • أنواع التطفل فى النيماتودا
  • أهم الأعراض التى تظهر عند الاصابة بالنيماتودا
  • كيفية أخذ عينات نيماتودية بأبسط الطرق
  • كيفية جمع العينات من النبات
  • المكافحة المتكاملة للنيماتودا وطرق المقاومة وأنواعها
  • الدلائل الوراثية التى يمكن تطبيقها فى مجال النيماتودا

مقدمة

تعتبر النيماتودا احدى مجموعات المملكة الحيوانية ، وهى تشبه فى مظهرها الديدان . وتعيش النيماتودا بأعداد كبيرة حرة فى المياة العذبة أو المياه المالحة أو فى التربة متغذية على النباتات ، كما أنها تهاجم الإنسان والحيوان وتسبب لهما أمراضاً مختلفة.
والنيماتودا حيوانات لا فقارية ، جانبية التماثل ، أجسامها غير مقسمة إلى حلقات اسطوانية دودية الشكل أو مغزلية ، وأحياناً تتميز بعض إناث النيماتودا خاصة ما يتطفل منها على النبات بأجسامها المنتفخة لتتخذ شكلاً ليمونيا أو كلويا أو كمثرياً.
ويتكون جسم النيماتودا أساساً من أنبوبتين تمثل الخارجية منها جدار الجسم وتمثل الداخلية القناة الهضمية ، ويمتلئ التجويف بينهما بسائل الجسم.
وتتميز النيماتودا أيضاً بأن لها نهاية أمامية توجد بها فتحة الفم وأخرى خلفية كما أن لها سطح ظهرى وآخر بطنى توجد عليه الفتحات البولية والشرجية والتناسلية.

ويغطى جسم النيماتودا من الخارج طبقة شفافة عديمة اللون ، ومرنة من مادة غير حية تعرف بالكيوتيكل وهى طبقة بروتينية تخلو تماماً من الكيتين وتفرزها طبقة الهيبودرمس الحية ، وتمتد طبقة الكيوتيكل داخل فتحات الفم والشرج وداخل الفتحة التناسلية .
وجدير بالذكر أيضاً أن النيماتودا أحيانا تتلون بلون محتويات القناة الهضمية ، وتعتبر منطقة الذيل فى النيماتودا من الصفات المورفولوجية التى يمكن استخدامها فى عملية التعرف المبدئى على نوع النيماتودا نظراً لإختلاف أشكالها.

ويمكن تقسيم النيماتودا إلى ثلاث مجموعات رئيسية تبعاً لأنواعها وبيئتها
1- نيماتودا التربة والنبات وأغلبها ميكروسكوبية يتراوح طولها بين 0.4 – 4 مم وعرضها بين 30 إلى 250 ميكرون ، ويلاحظ أيضاً أن نيماتودا النبات مختلفة الأحجام والأطوال.
2- نيماتودا بحرية طول بعض أنواعها يصل إلى 5 سم وعرضها يصل إلى 500 ميكرون.
3- نيماتودا تتطفل على الحيوانات ويزيد طول بعض أنواعها على المتر.
وتمر دورة حياة النيماتودا بخمسة أطوار، يحمل كل طور منها “الكيوتيكل” الخاص به وتتم عملية الانسلاخ بين طور والطور الذى يليه ويتكون ” الكيوتيكل” الجديد عادة قبل أن تتخلص الدودة من ”
الكيوتيكل” القديم.
ويلى طبقة ” الكيوتيكل” من الداخل طبقة ” الهيبودرمس” وهى طبقة خلوية وفى جميع أنواع النيماتودا تبرز هذه الطبقة جانبياً إلى الداخل فيتكون حبلان جانبيان ويقوم “الهيبودرمس” بإفراز طبقة “الكيوتيكل” للقيام بالعمليات البيولوجية واسعة النطاق خاصة التمثيل الغذائى فى اثناء نمو النيماتودا يلى طبقة “الهيبودرمس” طبقة من العضلات الطولية يبلغ سمكها خلية واحدة.
اما تجويف الجسم فهو تجويف غير حقيقى اى أنه غير مبطن بنسيج ” ميزودرمى” ويحتوى هذا التجويف على سائل الجسم.

دورة حياة النيماتودا "المتطفلة داخل الجذور"

دورة حياة النيماتودا "المتطفلة خارج الجذور"

ويحتوى جسم النيماتودا على
القناة الهضمية : وهى عبارى عن أنبوبة بسيطة فى التركيب تبدأ بفتحة الفم وتنتهى بفتحة الشرج.
الجهاز الإخراجى : يوجد فى النيماتودا بأشكال مختلفة تبعاً لتقسيم النيماتودا والمجموعة التى تنتمى إليها.
الجهاز العصبي : عبارة عن مجموعة من الأحبال العصبية التي تربطها الوصلات العصبية أماميا في منطقة المرئ وخلفيا في المنطقة الشرجية.
الجهاز التناسلي: ثنائي الجـــنس وقليل منه خناث ، وطرق التكاثر عديدة في النيماتودا مثل الإخصاب الخلطي والإخصاب الذاتي والأخصاب الكاذب والتكاثر البكري ، وأنثى النيماتودا المتطفلة تضع بيضاً بكميات أكبر مما تضعه النيماتودا غيرالمتطفلة ، وتضع نيماتودا النبات بيضها داخل أنسجة النبات إذا كان التطفل داخلياً . أويتحول جسم النيماتودا كلها إلى كيس يحفظ البيض كما في نیماتودا الحوصلات أو نصفها فى أكياس egg masses كما في نيماتودا تعقد الجذور.

أنواع التُطفل في النيماتودا

• تطفل خارجي

ويكون جسم النيماتودا خارج العائل ولاتدخل نسيج الجذور ولكن تتغذي فقط على الخلايا القريبة من سطح الجزرمثل نيماتودا التقصف .

• تطفل داخلى

أ‌. هجرة داخل النبات
النيماتودا تدخل النبات وتتجول فى الأنسجة مما يسبب ظهور كثير من التقرحات مثل نيماتودا التقرح

ب‌. مستقرة داخل النبات
وفيها يخترق الطور اليرقي الثاني جذور النبات ويستقربداخله وتتغذي على الخلايا المحيطة برأسها وذلك عن طريق غرز رمحها في هذه الخلايا دون أن يتحرك الجسم وتكمل دورة الحياه وهي مستقرة داخل الجذر مثل نيماتودا تعقد الجذور.

• نصف داخلية التطفل

ويكون فيها الطرف الأمامي من الجسم مغمورا في نسيج الجذر والطرف الأخر يبقى خارجيا مثل نيماتودا الموالح ونيماتودا القطن

أهم الأعراض التي تظهر على النبات عند الاصابة بالنيماتودا

أعراض تظهر فوق سطح التربة
• أصفرار النبات
• ذبول النبات
• ظهور بعض التبقعات على الأوراق
• تقزم النبات
• النمو غير الطبيعي للنبات
• ظهور التشوهات في الساق
• التدهور البطئ (نيماتودا الموالح) ويظهرفى صورة موت للأطراف الخضرية لأشجارالموالح.
ومن أهم الأعراض التي تميز الإصابة بالنيماتودا عن إصابات الآفات الأخرى أن الإصابة النيماتودية تظهر في الحقل على صورة (بقع خالية من النباتات) Batches ، أى أن الإصابة تكون مركزة في بعض المناطق بينما المناطق الأخرى لا تظهر فيها أى اصابة وذلك لبطئ تحرك النيماتودا في التربة.

أعراض تظهر تحت سطح التربة
• تعفن الجذور
• ظهور عقد على الجذور
• تقصف الجذور
• تقرح الجذور
• تقزم الجذور
• ظهور الانثى الكاملة على سطح الجذر”نيماتودا الحوصلات”

• أهم أنواع النيماتودا

• نيماتودا تعقد الجذور (ذات مدى عوائلى واسع)
• نيماتودا الموالح.
• نيماتودا القطن
• النيماتودا الحلزونية
• نيماتودا التقرح
• نيماتودا الحوصلات
• نيماتودا التقصف
• النيماتودا الخنجريه
ومن أهم هذه الأنواع التي تنتشر في محافظة الفيوم هي نيماتودا تعقد الجذورونيماتودا الموالح ونيماتودا القطن ، كما وجد فى بعض مراكز المحافظة نيماتودا التقرح والنيماتودا الحلزونية والنيماتودا الحلقية ، وأيضا بعض أنواع نيماتودا التقزم ، كما وجدت أيضاً أنواع نيماتودا الحوصلات في بعض المناطق المتفرقة بالمحافظة.
وبما أن النيماتودا لا يمكن رؤيتها بالعين المجردة فهناك بعض الأنواع التى تحتاج إلى عين اخصائية لرؤيتها ، ما عدا ذلك فإن المزارع لابد له من أخذ عينات والتوجه إلى مركز تحليل عينات النيماتودا بكلية الزراعة بالفيوم للتعرف على حجم المشكلة قبل البدء في عملية المكافحة ، حيث أن هناك بعض أنواع النيماتودا التي يمكن أن تتواجد بأعداد كبيرة ولكن ليس لها أي ضرر، بعكس بعض الأنواع التي يمكن أن يكون لها تأثير كبير على المحصول رغم أعدادها القليلة في التربة.

من اهم اعراض الاصابة بالنيماتودا ظهورها في الحقل في صورة غير منتظمة

الطرق المبسطة لأخذ العينات النيماتودية

•من التربة

حركة النيماتودا في التربة

تؤخذ العينات من التربة (خالية من الزراعات) بواسطة إسطوانة جمع العينات ( أوبواسطة جاروف وتأخذ العينات على أعماق مختلفة (۱۰-60سم) وأن يكون حجم العينة من 250-300سم3 وتؤخذ العينات من الأرض إما بطريقة عشوائية أو طريقة الزجزاج أو عن طريق الكروس على أن يكون عدد العينات يتناسب مع مساحة الأرض.
على سبيل المثال مساحة100 م۲ تؤخذ من 4-6 عينات 5۰0 م۲ من ۱۰-۱۲عينة ، 500۰ م۲ من ۲۸-۳۰ عينة . وفی حالة مسح مساحة كبيرة من الأرض يجب خلط كل ۲۵ عينة خلطأ جيدا حتى تصبح عينة مركبة ثم يؤخذ منها جزء للفحص في المعمل. ولابد أن توضع العينات في أكياس نايلون فور جمعها وأن توضع بقدرالإمكان في أماكن مظللة لحين نقلها إلى المعمل لاستخلاص النيماتودا .

• من أرض مزروعة

والعمق التى تؤخذ منه العينة في هذه الحالة يجب أن يتناسب مع عمق جذور هذه النباتات وخاصة الجذور الرفيعة. ويلاحظ أن تؤخذ العينات في هذه الحالة على عمق۳۰ سم تقريبا . أما في حالة الشجيرات والاشجار فتحفر التربة أولا على عمق حوالي ۹۰-۱۲۰ سم ثم تؤخذ العينات بعد ذلك والتي يختلط بها عادة قطع من الجذور الصغيرة التي تتغذي عليها النيماتودا.

طرق جمع العينات من النبات

تجمع عينات من جذور النباتات الضعيفة ولا تجمع من جذور النباتات الميتة ويفضل اقتلاع النبات برفق حتى لا تتمزق الشعيرات الجذرية التي غالباً ما تحتوى على النيماتودا بأعداد كبيرة. وتوضع العينات في أكياس بلاستيك مع تسجيل كل البيانات الهامة على الكيس مثل نوع وعمر النبات ورقم العينة وتاريخ الحصول عليها وأيضا نوع التربة. ولابد أن تحفظ العينات في مكان بارد او ظليل لحين إرسالها إلى المعمل لفحصها.

المكافحة المتكاملة للنيماتودا

تنقسم طرق مقاومة النيماتودا بصفة عامة إلى ثلاثة مجاميع رئيسية:
1- الطرق والاجراءات الزراعية وتتمثل في:
• عمليات الخدمة الزراعية.
• ترك الأرض بور.
• عمر التربة بالماء.
• مقاومة الحشائش.
• مواعيد الزراعة والحصاد .
• أضافة الأسمدة.
• اتباع الدورة الزراعية.
• Mulching
• الحجر الزراعى.

2- الطرق الطبيعية
• الحرارة ” أشعة الشمس” تغطية التربة بالبلاستيك الاسود
• نقع البادرة فى الماء المعالج
• الأشعة فوق البنفسجية
• استخدام بعض المستخلصات النباتية كمبيد طبيعى

3- طرق المقاومة الكيمياوية
وذلك باستخدام المبيدات الكيماوية.
الا ان وزارة الزراعة تضع كثيراً من المحددات والمعايير لاستخدامها.

المقاومة البيولوجية للنيماتودا

معنى المقاومة البييولوجية
هو الحد من نشاط طفيل او كائن ممرض وكذلك التقليل من الضرر الذى يحدثه بالاستعانة بكائن حى آخر.
ولا تقتصر المقاومة البيولوجية على استخدام الاعداء الطبيعية فقط ، بل تتعدى ذلك الى استخدام المصايد النباتية او استخدام النباتات المتنافرة مع النيماتودا وكذلك استنباط الاصناف المقاومة للاصابة بالطرق الوراثية المختلفة.
أولا؛ الاستفادة من الأعداء الطبيعية وذلك مثل..
• الفطريات
ويوجد حوالي أكثر من ۱۰۰ نوع تعرف بتغذيتها على النيماتودا ، و تنقسم إلى عدة أنواع
1- فطريات تكون هيفاتها مصائد لزجة تقع فيها النيماتودا عند مرورها عليها وتظل تقاوم لفترة وتنهار بعد ذلك مقاومتها وتموت ، ويبدأ الفطر بعد ذلك في تكوين نموات تخترق جدار جسم النيماتودا حيث تنتفخ مثل هذه النموات مكونة جسما منتفخا تنمو فيه هيفات تتغذي على محتويات جسم النيماتودا .
2- فطريات لها عقد لاصقة وهى كروية الشكل تقريبا ومحملة على حوامل ويتم أسر النيماتودا عند التصاق هذه العقد الفطرية بجسمها .
3- فطريات تكون هيفاتها مصائد ميكانيكية عبارة عن حلقات بعضها غير قابض، وأثناء مرورالنيماتودا من خلال الحلقة المكونة من ثلاثة خلايا فإنه سرعان ما تنمو الهيفات وتمتص محتويات الجسم ، وهناك أنواع أخرى من الفطريات تكون لها حلقات قابضة وخلاياها حســاسه ، وعند مرور النيماتودا خلال مثل هذه الحلقات فان احتكاك أجسامها بخلايا الحلقية كفيل بأن يجعل الأخيرة تنتفخ ويتضاعف حجمها ليصبح قدر حجمها الأصلى ثلاث مرات ، وذلك تصبح النيماتودا في قبضة الفطر.

 

• البكتيريا والفيروس
عندما تصاب النيماتودا ببعض أنواع البكتيريا فإنها تتوقف عن الحركة وتفقد حيويتها وتموت

• الأوليات
وهي تبتلع ديدان النيماتودا مثل الأميبا.
• الهدبيات
ويوجد بعض انواع منها تستطيع أسر وابتلاع النيماتودا
• السوطيات
ولوحظ أن منها ما هو داخل أمعاء بعض النيماتودا .
• الجرثوميات
التي لوحظ التصاقها على “الكيوتيكل” الخارجي للنيماتودا لها القدرة على تكوين نموات تخترق “الكيوتيكل” وتسبب ضرراً قاتلا للنيماتودا .
• الحيوانات الفقارية
التي تتغذي على النيماتودا مثل بعض الديدان المفلطحة والديدان الحلقية وبعض الحشرات مثل حشرة “الكولمبولا”، وأيضا بعض أنواع الحلم وكذلك بعض أنواع مفصليات الأرض.
كما توجد أيضا النيماتودا المفترسة وهي تتغذي على بعض أنواع نيماتودا النبات و تستطيع أن تبتلع النيماتودا بأكملها نظراً لما يتسم به تجويف دمها من مرونة.

ثانيا: استخدام النباتات المتنافرة مع النيماتودا
ويقصد بها أن زراعة النباتات غير القابلة للإصابة بنوع معين من النيماتودا يعمل على تقلیل الكثافة العددية لها في التربة ، وأيضا هناك بعض الأنواع تعمل على تقليل الكثافة العددية في الترية عن طريق الافرازات السامة التي تفرزها جذور بعض أنواع النباتات الطبية التى تفرز جذورها بعض المركبات المعروف عنها تأثيرها على بعض أنواع النيماتودا ، كما وجد كذلك أن زراعة نبات “المارى جولد” مع المحاصيل القابلة الأصابة بنيماتودا التقرح يؤدی إلى تقليل الكثافة العد دية لهذه الديدان بدرجة ملحوظة .

ثالثا: استخدام المصائد النباتية
وهي قدرة بعض النباتات على اجتذاب جذورها للنيماتودا المتطفلة ومع ذلك فهى لا تعتبرعوائل لها نظرا لأن النيماتودا لا تستطيع أن تتم دورة حياتها داخل الجذر وهي تعمل على تقليل الكثافة العددية للأفة في التربة وبالتالي تقلل من حدة الخطورة على المحصول.
وعلى النقيض تماما مما سبق قد تستخدم نباتات شديدة القابلية للإصابة ثم يتخلص منها وفي الوقت المناسب أي قبل أن تتم النيماتودا دورة حياتها وتبدأ في التكاثر ، وتعتبر مثل هذه الطريقة غير عملية على الاطلاق نظراً لأنها باهظة النفقات فضلا عن أن في إتباعها مخاطرة كبيرة بمعنى أنه إذا لم يتخلص من النبات في الوقت المناسب فإن النيماتودا سوف تبدا في التكاثر الأمر الذي بؤدي إلى زيادة أعدادها بدرجة كبيرة وبالتالي استفحال ضررها .
كما أشارت كثير من البحوث الحديثة إلى أن هناك بعض أنواع نباتات ومنها النباتات الطبية والعطرية لها تأثير مميت على كثير من أنواع النيماتودا ، حيث ثبت أن جذور هذه النباتات تفرز بعض المركبات الكيميائية الثانوية التي لها تأثير كبير على أعداد النيماتودا في الترية مثل الأقحوان والدمسيسة والبردقوش وبذور الكتان.
ويلجأ العلماء حاليا إلى برامج المكافحة المتكاملة لآفة النيماتودا وهي البرامج التي تعتمدعلى إستخدام كل الطرق سالفة الذكر سواء كانت الطرق والاجراءات الزراعية أو الطرق الطبيعية أو طرق المقاومة الكيماوية أو المقاومة البيولوجية لمقاومة هذه الآفة.
وتعتبر برامج المكافحة المتكاملة أيضا أحد الطرق الاقتصادية على المدى الطويل ، حيث يقتصر إستخدام المبيدات فيها عند الضرورة القصوى فقط لتقليل الضرر والفاقد في المحصول وأيضا للإقلال من التلوث البيئي الذى يحدث من جراء إستخدام المبيدات والمحافظة على صحة الإنسان وتحسين وتشجيع دورالأعداء الطبيعية في البيئة .

وتعتبر محافظة الفيوم من المحافظات التي لا يستخدم فيها المبيدات حاليا ويقيد استعمالها فقط للحالات القصوى والمحاصيل القومية ذات العائد الاقتصادي وذلك بعد الرجوع الي وزارة الزراعة لتحديد الكميات وتواريخ الإستخدام.
ولتصميم برامج المكافحة المتكاملة للحصول على أحسن النتائج لمقاومة النيماتوداً كان لابد من اللجوء إلى التطبيقات الحديثة Biotechnology ومعنى التكنولوجيا الحيوية هي كل الطرق والتقنيات المختلفة التي تستخدم الخلية الحية سواء كانت نباتية أو حيوانية أوميكروبية لإنتاج مادة ذات فائدة أو تخليق كائن يحتوى على صفات وراثية مرغوبة أوالتخلص من صفة وراثية غير مرغوبة . ومن أهم الطرق والتقنيات المستخدمة في مجال النيماتودا زراعة الأنسجة والبيولوجيا الجزئية والهندسة الوراثية.
والمقصود بالهندسة الوراثية هو انتاج نبات أو كائن حي مادته الوراثية تحتوى على جين جديد يتحكم في ظهور صفة جديدة مرغوب بها أوخالي من جين ضار مسئول عن صفة غير مرغوب فيها حيث تعتبر طريقة التربية التقليدية لها عيوب من أهمها دمج المادة الوراثية كلها أثناء التزواج بما تحتويه من جينات مرغوبة وغير مرغوبة ، هذا إلى جانب الوقت الطويل والنتائج الغيرأكيدة التى يمكن التوصل إليها بعد أعوام طويلة .
أما المقصود بالخريطة الجينية Gene mapping هو تحديد مكان وحدود الجين على الحامض النووى الكلى لأي كائن حي بما يحتويه من الجينات الفعالة أو الجينات الغير فعالة ويعتبر استخدام التقنيات الحديثة ودمجها في برامج المكافحة المتكاملة كما في مجال مكافحة النيماتودا هام للأسباب التالية :
1- التعرف على أنواع النيماتودا المختلفة لتحديد النباتات المقاومة Resistant cultivars تحديدا دقيقا لأنه من الصعب اعطاء توصية باستخدام نوع معين من النباتات المقاومة دون التعرف الدقيق والكامل
” على النيماتودا من حيث الجنس والنوع والفصيلة والسلالة ” .
2- تحديد الكم العددي من النيماتودا Population dynamics وذلك لأهميتها في تحديد الأصابة بالنسبة للمحاصيل المختلفة.
3- لتطبيق المقاومة البيولوجية للنيماتودا .
4- لسرعة ودقة تحديد التداخل بين أنواع النيماتودا المختلفة في الحقل الواحد .
5- عند التخطيط للدورات الزراعية والتي لابد فيها من التعرف الدقيق على أنواع النيماتودا المختلفة .
6- للتعرف على الجينات المقاومة في النبات وإمكانية عزلها .
7- استخدام بعض طرق الهندسة الوراثية لانتاج نباتات مقاومة للنيماتودا.
وتعتبر البيولوجيا الجزيئية Molecular Biology من أهم التقنيات الحديثة التي يسعی العلماء لتطويرها والاستفادة منها يوما بعد يوم. ومنذ أوائل هذا القرن بدأ الاهتمام بهذه العلوم حيث أثبتت التجارب أن الصفات المورفولوجية للآفات أصبحت غير كافية لتحديد الاختلافات والطفرات التي ظهرت حديثا داخل الجنس الواحد ، نتيجة للتلوث البيئی واستخدام المبيدات.
وبتقدم العلوم ظهرت طرق التفريد الكهربائي للبروتينات والتي وفرت نوعا من الدلائل يسمي بمشابهات الانزيمات Isoenzymes وقد تم إستخدام هذا المقنن على نیماتودا تعقد الجذور ونيماتودا الحويصلات ، وهذه الطريقة تعتمد أساسا علي Isozyme differences in esterase and malates dehydrogenase ووجود بعض الاختلافات في esterase patterns يسمح بعمليات التعرف على الأنواع المختلفة من النيماتودا ، ولكن وجد أن اليرقة الواحدة للنيماتودا لا تحتوي على کمية كافية من الانزيم الذي يسمح بعملية التعرف الصحيح والدقيق. ثم ظهرت الثورة الحقيقية مع ظهور تقنيات البيولوجيا الجزيئية التي عن طريقها يتم رسم الخرائط الوراثية للآفات المختلفة .

والمقصود برسم الخرائط الوراثية هو تحديد المواقع النسبية لمقاطع المادة الوراثية المختلفة في المحتوى الوراثي DNA Fragments للكائن وتحديد مدى ارتباط هذه المقاطع بالصفات الوراثية. وتسمى هذه المقاطع من المادة الوراثية بالدلائل Markers
وقد وفرت تقنيات البيولوجيا الجزيئية نوعين جديدين من الدلائل الوراثية التي تتميز بوفرة عددها ، وبذلك يمكن تغطية المحتوى الكلى لجميع الكروموسومات (التركيب الوراثی) .
والأساس العملي في دور تقنيات البيولوجيا الجزيئية هو استخدام قطعة صغيرة من DNA يتراوح طولها من ۹-۱۰ قواعد نيتروجينية للتعرف على مقطع أو مقاطع معينة من الـ DNA يتم تخليقها بصورة متكررة عن طريق انزيم بلمرة خاص يسمی ” تاك بوليميريز ” Taq Polymerase ويعتمد ظهور التباين بين جزيئات الـ DNA للأفراد المختلفة على النتائج المتحصل عليها من التفاعلات الناتجة عن تقنية تسمى PCR باستخدام التفريد الكهربائي فيكتشف التباين بظهور حزم Bands بصفة معينة في بعض الأفراد واختفائها في بعض الأفراد الأخرى.
وهناك نوع آخر من الدلائل يسمى RFLPS وهذا النوع من الدلائل يتوقف على التباين في تتابعات القواعد المكونة ل لمادة الوراثية DNA من الأفراد المختلفة وهضمها باحد إنزيمات القطع المتخصصة Restriction Enzymes ثم يتم تفريدها كهربائيا في وسط جيلاتيني Agrose gel electrophoresis واظهار التباين الموجود في عينات الـ DNA المختلفة باستخدام ما يسمى Probe وهو عبارة عن قطع من ال DNA المرسوم .
وعند استخدام Scar primer وهو عبارة عن مقطع محدد وخاص من ال DNA لتوضيح الفرق بين الأنواع المختلفة لافة معينة حيث أن scar primer متخصص لكل نوع من أنواع هذه الآفة.
كما يمكن إستخدام RAPD-PCR لدراسة الاختلافات الوراثية الموجودة بين التجمعات المختلفة للآفات ، ويعتمد ظهور التباين بين جزيئات الـ DNA للأفراد المختلفة على النتائج من تفاعل الـ PCR باستخدام التفريد الكهربائي فيكشف التباين عن ظهور حزم Bands بصفة معينة من بعض الأفراد واختفائها في بعض الأفراد الأخرى وذلك بعد إستخدام أنواع مختلفة من البريمرز.
وكان الاتجاه الصحيح إلى استخدام ال DNA Markers وهي افضل طرق الهندسة الوراثية للفصل بين الأنواع حيث يتم الاعتماد على الحامض النووى DNA الذي لا يختلف تركيبه باختلاف اطوارالآفة ، خلال دورة الحياة الكاملة أو في حالات الظروف المختلفة التي قد تمر بها الآفة . ولذلك فإن الحامض النووى الـ DNA يعتبر ثابت .

وكما ذكرنا من قبل أن هناك نوعين من الدلائل الوراثية التي يمكن تطبيقها في مجال النيماتودا رغم أن معظم الأبحاث العلمية الحديثة تشير إلى أهمية النوع الثاني من الدلائل الوراثية مقارنة بالنوع الأول وهما:
1- Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLPS).
2- Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPDS).
ويعتبر النوع الثانى من الدلائل الوراثية الأكثرشيوعا في مجال النيماتودا وذلك لأنها تعتمد علی کمية ضئيلة من ال DNA لإنتاج نسخ عديدة من قطع معينة بواسطة تقنية تسمى
Reaction (PCR) Chain Polymerase ولقد استخدمت بتوسع كبير حيث انها يمكن ان تعتمد على يرقة واحدة فقط أو نيماتودا واحدة فقط ، وبذلك يمكن ضمان دقة وسلامة العينة والتعرف الحقيقي على النوع أو السلالة . ويمکن استخدام هذه الطريقة في بعض الحالات كوجود عينة بها أنواع مختلفة من النيماتودا . وتعتمد هذه الطريقة أساسا على الخطوات التالية :
• فصل ال DNA وتنقيته . وتمر عملية الفصل بخطوات عديدة واضافات لمواد كيماوية عديدة ولكل منها دوره الخاص في تنقية ال DNA
• التفريد على جهاز التفريد الكهربي Electrophoresis .
• تحديد نوع الدلائل الوراثية التي سوف تستخدم سواء كانت RFLPS أو RAPDS

ومع التقدم المستمر فى مجال البيوتكنولوجى ظهر جهاز تحليل وقياس درجة التمثيل الوظيفى للجينات فى الخلية Microarry Gene Expression وتعتبر بحوث الميكرواري نقلة كبيرة في مجال
بحوث المبيدات والمنتجات الزراعية والهندسة الوراثية لما له من قدرة فائقة في معرفة درجة تمثيل الجينات فورا داخل الخلية وهو يوضح قدرة الجين على تمثيل نفسه داخل الخلية ويمكن عن طريق هذا الجهاز إستخدام آلاف الجينات على شريحة واحدة لمعرفة النتائج فورا مما يوفرالوقت والجهد ويستخدم حاليا في مجال نيماتودا فول الصويا ونيماتودا القطن .

وفي محافظة الفيوم تم لأول مرة على مستوى الجمهورية إستخدام تكنولوجيا البيولوجيا الجزينية في مجال النيماتودا وذلك لتحديد الاختلافات الوراثية لنيماتودا تعقد الجذور بالمحافظة والتي أدت إلى كسر المقاومة في بعض أنواع الطماطم المقاومة لهذه النيماتودا حيث قامت مجموعة العمل بعمل مسح شامل لأماكن تواجــد هذه النيماتودا بالمحافظة ولقد أثبتت عمليات المسح تواجدها على نطاق واسع في ۹۷ منطقة على مستوى المحافظة.

ولقد تم إستخدام أنثى واحدة من نيماتودا تعقد الجذور من كل منطقة من المناطق المحددة لإكثارها ولقد تم ذلك معمليا في أطباق بترى بأستخدام تكنولوجيا زراعة الأنسجة عن طريق تكاثر النيماتودا فى بيئة صناعية معينة GambergB5 Mediaعلى نبات الطماطم ولقد تم استخدام انثی واحدة فقط كما ذكرنا من قبل وذلك للتاكد من عدم الخلط بين الأنواع المختلفة من النيماتودا والتى بدأت فى التكاثرعلى جذور الطماطم تحت ظروف زراعة الانسجة في المعمل وبعد ثلاثة أشهر أصبحت أطباق بتری تحـتوى على كم كبير من النيماتودا التي إلى مجموعة واحدة فقط تم بعد ذلك استخلاص الريبوزومال DNA من كل مجموعة نيماتوديه على حــدى ، ثم أجريت في عــدة تجارب متتالية للوصول الى الاختلافات الوراثية داخل مجموعات نيماتودا تعقد الجذور بالمحافظة وذلك على النحو التالى :
– البدء بتجربة Internal Transcript Spacer ITS وهي عبارة عن منطقة معينة محصورة بين
The repeating array of Nuclear 18S and 28S ribossomal DNA Genes
ويستخدم ITS للتعرف على الأجناس المختلفة للنيماتودا ، وذلك بإستخدام نوعين من البريمر رقم 5367 وتركيبه 5 TTGATTACGCCCTGCCCTTT 3 وبريمر رقم 5368 وتركيبه 5TTTCACTCGCCGTTACAGG 3 وتكون البداية دائماً بهذه التجربة للتأكد من جنس النيماتودا قبل ای تجارب أخرى ، حيث ان هذه التجربة يستخدم فيها النوعين السابقين من البريمر لاكثار منطقة الـ ITS من كل جنس من اجناس النيماتودا المختلفة وذلك لان لكل جنس من الاجناس حزمة Band تميزها عن الأنواع الأخرى.

ولقد اتضح من تجربة الـ ITS انها تعطى حزمة Band على مسافة bp760 في حالة نیماتودا تعقد الجذور بينما في حالة نيماتودا التقرح فإن ITS يعطى حزمة على مسافة bp610 بينما نيماتودا التقصف يعطى حزمة عند bp1200
بعد أن تم التأكد من أن العينات كلها لنيماتودا تعقد الجذور تم استخدام منتج ال ITS في نوع آخر من الدلائل يسمي RFLPS وهذا النوع من الدلائل يتوقف على التباين في تتابعات القواعد المكونة للمادة الوراثية DNA من السلالات المختلفة والتعرف على هذا التباين يتم عن طريق عزل وتنقية المادة الوراثية DNA من الأفراد المختلفة وهضمها بأحد إنزيمات القطع المتخصصة Restriction Enzymes

– ثم يتم تفريدها كهربائيا في وسط جيلاتينىgel electrophoresis Agrose وإظهار التباين الموجود في عينات الـ DNA المختلفة ، ولقد تم استخدام إنزيمات القطع ، وهى عبارة عن انزيمات موجودة في بعض أنواع البكتريا ، وهي تبدأ في تقطيع ال DNA في اماكن محددة ، وإما أن يكون هذا القطع منتظم أو غير منتظم ولكن لكل إنزیم مكان محدد لقطع DNA
– ولقد اسفرت نتائج التجربة أنه عند إستخدام إنزيم المتخصص Hind III أعطي حزمة قوية عند 560 bp وحزمة أخرى ضعيفة عند 200 bp وكانت هذه النتيجة مماثلة تماما لما تم الحصول عليه مسبقاً لنيمـاتودا تعقـد الجذور M .incognita و M.javanica .
وعند إســـــــتخدام الأنزيم المتخصص HinfI ظهرت حزمتان إحداهما bp440 والآخـــــري bp 320 وعند إستخدام الإنزيم المتخصص Dra I ظهر أربع حزم كالآتي : 220 ، 200 ،180 ، 160 bp ،
– ومن النتائج السابقة وتکرارها مع العينات المختلفة بالمحافظة إتضح أن نيماتودا تعقد الجذور في جميع التجمعـات الموجودة في محافظة الفيوم اما أن تكون M.javanica او M .incognita لذا تم اللجوء الى تجربة Scar primer للتفرقة بينهما.

وهده التقنية عبارة عن مقطع محدد وخاص من الـ DNA لنيماتودا M.javanica وهو يستخدم للتفرقة بينها وبين الM.incognita لذلك عندما أستخدم هذا ال Scar مع عينات النيماتودا المختلفة من محافظة الفيوم لم تعط أي حزم ، وهذا يدل على أن النيماتودا الموجودة في المحافظة هى M.incognita وعند استخدام تجربة ال Multiplex test وهو يستخدم للكشف عن الأنواع المختلفة لنيماتودا تعقد الجذور وذلك عندما يكون في الحقل الواحد أكثر من نوع حيث يستخدم مجمـــوعة من primers لإثبات النسب المختلفة منها داخل هذا الحقل .
وعند استخدام تجرية ال Host preference test لتحديد ما إذا كانت الـ M.incognita
الموجودة في الفيوم تابعة ل Race1 أو Race3 ولقد اتضح من نتائج هذه التجربة أن معظم
التجمعات النيماتودية الموجودة في هذه المحافظة تابعة ل Race1 ، وقليلا منها يتبع Race3.

وتعتبر طريقة الـ PCR-RAPD أيضا من الطرق الحديثة التي تستخدم حاليا للتعرف على الاختلافات الوراثية الموجودة بين التجمعات المختلفة لنيماتودا تعقد الجذور، والأساس العلمي لهذه التقنية هو استخدام قطعة صغيرة من DNA يتم تخليقها بصورة متكررة عن طريق إنزيم بلمرة خاص يسمي تاك بوليميريز Teq Polymerase ويعتمد ظهور التباین بين جزئيات ال DNA للافراد المختلفة على الناتج من تفاعل ال PCR باستخدام التفريد الكهربائي فيكشف التباين عن ظهور حزم Bands بصفة معينة في
بعض الأفراد واختفائها في بعض الأفراد الأخرى . وفي هذه التجربة تم استخدام 10 قطع صغيرة من ال DNA والتي تسمى بريمرز Primers وهي كالتالي :
OPA1.OPB11.0PB10.OPG2.OPG4.OPG6.OPA11.OPA12.OPB17.OPB18
ولقد تم اختبار كل هذه البرايمرز مع عزلات نیماتودا تعقد الجذور M.incognita والتي تم جمعها من خمس مراكز مختلفة لزراعات الخضر بالمحافظة ، ولقد وجد ان بعض من هذه البريمرز تعطى نتائج طيبة ، ةالبعض الآخر لا يعطى أى نتائج ، فعلى سبيل المثال وجد أن OPA11 ، OPB11 ،OPG1 يعطى نتائج غير متكاملة وأيضا يعطى حزم غير واضحـــــة المعالم ، بينما البعض الاخر نتائج طيبة وأوضح العلاقات الوراثيــة بين تجــمعات النيماتودا مثل بريمرز ،
OPA12.OPG2. OPG4. OPB17.OPB1
ويعتبر البريمر OPG2 من احسن البريمر التي تم استخدامها في هذه التجربة حيث إنها اعطت حزم واضحة المعالم منتظمة بين تجمعات النيماتودا المختلفة ، كما أظهر استخدام هذا البريمر أيضأ التباين فى ظهور الحزم Bands بصفى معينة فى بعض المجموعــات النيماتودية واخــتفائها في مجموعات أخرى حيث يمثل كل عمود من الأعمدة الموجودة في مجموعة نيماتودية ولقد أمكننا اســتخدام هذه النتائج لعمل
دراسة لكل التجمعات المختلفة الموجودة لنيماتودا تعقد الجذورالـ M.incognita بمحافظة الفيوم عن طريق رسوم الدندوجرام Dendogram وأيضا لتحدد درجة القرابة بين هـــذه التجمعات والتي تعتمد على وجود
اوعـــدم وجود Bands وذلك عند استخدام هذا البريمر. ويتم تفريغ هذه البيانات عن طريق جهاز
Gel Documentation System الموجود فى المعمل. وذلك باستخدام رقمی صفر
ليدل على عدم وجود ال Band ورقم واحد لوجود ال Band وذلك في نفس ال Gel حيث انه لضمان نجاح ودقة هذه التجربة لابد تكرارها ثلاث مرات على الاقل لضمان أن هذه ال Bands دائماً متواجدة من هذه البريمر.

وبعد ذلك تم إستخدام الطرق الحسابية لقياس درجة التشابهة (القرابة بين هذه التجمعات) ومن أهم هذه الطرق Nei& Li’s Coefficients Genetic Similarity= EN×Y/ ENX+Y×ENY
حيث ان ENXY = عدد ال Band المتشابهة بين النوع أو الصنف X
NX = عدد ال Bands في النوع أو الصنف Y
NY = عد د ال Bands في النوع او الصنف Y
وعن طريق ذلك تم التواصل الى وجود 10 مجموعات (Clusters) لكل من هذه التجمعات النيماتودية لنيماتودا تعقد الجذور M. incognita الموجودة بمحافظة الفيوم .

كما إتضح أيضأ أن هناك بعض التجمعات النيماتودية متشابهة تماما مثل مجموعة ٣ ومجموعة 4 وجـــاري الان توضيح العلاقة بين هذه المجموعات على المستوى الفعلى بالمحافظة .
ولقد تم الاستفادة من هذه النتائج بعمل دراسة أولية على جين المقاومة في نبات الطماطم “جين MI ” وهو جين مقاوم لنيماتودا تعقد الجذور ولقد تم نقله عن طريق الهندسة الوراثية من أحد أنواع الطماطم البرية إلي بعض أنواع الطماطم التجارية Commercial Cultivares . وفي السـنوات الأخيرة أوضحت التجارب أن إرتفاع درجات الحرارة عن معدلاتها الطبيعية وعدم استقرارها يؤدى إلى الحد الكبير من فاعلية هذا
الجين ، كما أن الإختلافات الوراثية التي تظهر في المجموعات المختلفة لنيماتودا تعقد الجذور أدت ايضا إلى كسر هذه المقاومة، لذا قمنا بالحصول على التركيب الوراثى لهذا الجين من الشبكات المعلوماتية وهو جين يتركب من bp 384ولقد تم اختيار احد المقاطع الموجودة في ذلك الجين في المسافة بين 781bp و 3661bp وهذه المسافة تنحصر بين مقطعى الانزيم القاطع Hind III ولقد تم تحضير 14 بريمرز فى هذه المسافة كل منهم يحتوى على 22 الى 25bp ولقد تم إجراء عدة إختبارات مختلفة عن طريق إستخدام الـ PCR واستخدام زوجين من البريمرز في كل تجربة لعمل DNA marker لإستخدامه مستقبلاً فى تحديد وجود أو عدم وجود MI جـين في الأنواع المختلفة للطماطم .
ولقد أثبتت الدراسة أن زوجين البريمرز ( 2+13 ) أعطت أحسن النتائج وحاليا يتم عمل Cloning لهذا المقطع باتباع نفس الخطوات المستخدمة في حالة Gene Cloning والمقصود بهذه التقنية هی إكثار جين معين بدمجه في بلازميد البكتريا ثم نقل هذا البلازميد إلى البكتريا نفسها ، ومن أمثلى هذه البكتريا التى تستخدم بكثرة فى هذا المجال )ُE,coli) وذلك لقدرتها على التكاثر السريع وبمعدل عالي في فترة قصيرة، حيث يمكن الحصول على نسخ عديدة من الجين المطلوب فى فترة قصيرة . وفي بعض الأحيان يستخدم تفاعل البلمرة المتسلسل PCR في انتاج نسخ عديدة من الجين في ساعات معدودة دون اللجوء الي البكتريا .

ونظرا لأن محصول الطماطم يمثل تقريبا ۵0٪ من زراعـات الخضربمحافظة الفيوم ، فقد قام الفريق البحثى بمعمل النيماتودا بعمل دراسة شاملة عن أنواع الطماطم المقاومة والغير مقاومة لنيماتودا تعقد الجذور بالمحافظة ، ولقد تمت هذه الدراسة على أنواع مختلفة من نباتات الطماطم بعضها يحتوى على جين المقاومة MI وبعضها لايحتوى عليه، كما أن بعض الأنواع تقاوم إرتفاع درجات الحرارة وبعضها لايتحمل درجات الحرارة المرتفعة ولقد أستخدمت هذه الدراسة تقنية زراعة الأنسجة حيث تم زراعة الطماطم
في أطباق بترى كما تم إستخدام هذه التقنية في اكثار النيماتودا في المعمل وذلك لتحديد ودراسة مقاومة الأنواع المختلفة من الطماطم لنيماتودا تعقد الجذور وايضا للإختلاف في درجات الحرارة وتأثير هذه الاختلافات على استقرار جين المقاومة MI فی نباتات الطماطم ،وتم أيضا في هذه الدراسة تتبع تطور النيماتودا داخل جذر النبات فى درجات الحرارة المختلفة.
ولقد أثبتت الدراسة أن إرتفاع درجات عن المعدل الطبيعي يؤثر على جين المقاومة في نبات
الطماطم MI.
حيث ثبت أن نباتات الطماطم التي تحتوى على MI جين تصبح غير مقاومة لنيماتودا تعقد الجذور اذا تعرضت هذه النباتات لدرجات حرارة مرتفعة لفترات طويلة ، كما ثبت ايضا من التجارب ان الاختلافات الوراثية بين مجموعات نيماتودا تعقد الجذور والتي يمكن أن تكون ناتجة عن التلوث البيتي واستخدام المبيدات النيماتودیه بطرق خاطئة في بعض حقول الطماطم أدى إلى كسر جين المقاومة في بعض أنواع الطماطم المقاومه للنيماتودا لذا ينصح دائما بترشيد استخدام المبيدات لما له من آثار سيئه على البيئه والإنسان والنبات ذاته .

ولقد شارك في هذه التجأرب فريق بحتى يضم السادة :
• د/عزت عثمان ـ مدرس بقسم وقاية النبات
• أ. ايهاب محمد عبد اللاه ـ مدرس مساعد بكلية علوم بنى سويف
• أ. مروه سيد فؤاد. ماجستير بكلية الزراعة بالفيوم
• أ. أسماء سيد الخروبى – ماجستير بكلية الزراعة بالفيوم
• أ. ريهام محمد يوسف – ماجستير بكلية الزراعة بالفيوم
• أ. على اسماعيل على – محضر المعمل
فضلاً عن الاستفادة بخبرات الاساتذة من معهد بحوث الهندسة الوراثية التابع لمركز البحوث الزراعية بالجيزة .
كما يوجد كثير من المستحدثات العلمية فى طرق مكافحة النيماتودا ومن اهمها استخدام المستخلصات النباتية وخاصة من النباتات الطبية والعطرية التى تثبت تاثير على معظم انواع النيماتودا ، كما ان هناك المخصبات النباتية الطبيعية من بعض النباتات وتستخدم بعد طحنها واضافتها فى التربة او مستخلصات من هذه النباتات التى تثبت تاثير بالايجاب على نمو النباتات بزيادة النمو الخضرى والجذور بشكل ملاحظ.
وفى نفس الوقت لها تاثير سلبى على 80% من الاعداد النيماتودية فى التربة ، حيث تتضاءل اعدادها لتصل الى 10-20% من الاعداد بعد اضافة هذه المنشطات الطبيعية فى التربة يظهر تاثيرها على المجموع الجذرى والخضرى للنبات.

الفهرس

مدير وحدة معامل ابحاث النيماتولوجى والبيوتكنولوجى – كلية الزراعة – جامعة الفيوم

Subscribe
نبّهني عن
guest
0 تعليقات
Inline Feedbacks
View all comments